夜になると展示物が動きだす不思議な博物館を舞台に、そこで働く夜間警備のラリーと展示物のドタバタ劇を描いた大人気のファンタジー・コメディー「ナイトミュージアム」シリーズがアニメーションシリーズで帰ってきた。
高校生のニッキー・デイリーはアメリカ自然史博物館の警備員のアルバイトを始めることに。日が暮れると魔法の石板によって展示物に命が吹き込まれる、この博物館の秘密を知っているニッキーは父ラリーの跡を継ぐ。
ニッキーは小さいころからの友達であるテディやサカジャウィア、レクシーとの再会を喜ぶが、復讐(ふくしゅう)に燃えるカームンラーが地下から逃げ出し、冥界から自らの軍団を呼び戻そうとたくらむ。ニッキーはカームンラーからみんなを救うために奔走する。
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